Валидиране на смес от rK26 и rK39 антигени от ирански щам на Leishmania infantum за откриване на антитела срещу Leishmania в човешки и резервоарни гостоприемници

Чувствителността и специфичността на диагностичните тестове, които понастоящем се използват в Иран за оценка на CVL при асимптоматична и симптоматична VL в полето, са оспорени, което има отрицателно въздействие върху ефективността на мерките за контрол14. Много ендемични региони имат хетерогенност на лайшмания паразити. В конкретна популация, тестове, базирани на хомоложни лайшмания антигени са необходими за откриване на случаи, които са трудни за диагностициране с наличните в момента тестове15.

Настоящото проучване показва, че комбинирането на rK39 и rK26 от ирански щам на L. infantum в тест с една ямка има висока чувствителност и специфичност за диагностика на VL както в симптоматични, така и в асимптоматични резервоари. Този тест е проведен, за да превъзхожда CA ELISA по отношение на специфичност, чувствителност и съгласие с DAT.

Това проучване се основава на предишните ни резултати, където вече показахме рекомбинантния rK39 антиген от ирански щам на L. infantum (MCAN / IR / 14 / M14 с номер за достъп на GenBank KT201383) показа висока чувствителност и специфичност при идентифициране на случаи на хора и кучета със симптоматичен VL13.

rK39 антигенът е 39-аминокиселинен повтарящ се имунодоминантен В-клетъчен епитоп на 230 kDa свързан с кинезин протеин на L. chagasi и rK26 хидрофилни антигени имат 11 копия на 14-аминокиселинно повторение16. Наскоро Farajnia et al. описва висока чувствителност (96,8%) и специфичност (100%) при използване на rK26, произведен от ирански щам на L. infantum при VL серодиагностика17. Въпреки това, когато rK26 от L. donovani щамът е изследван в Индийския субконтинент, чувствителността на теста е спаднала до само 38%, докато в Бразилия е установено, че само 56% от случаите на VL са положителни16, 18.

Кучетата с клинични признаци на лайшманиоза са основният резервоар на L. infantum за хората.

В райони, където зоонозният VL е ендемичен, разпространението на L. infantum при кучета често е високо, докато много от тях са безсимптомни. Домашните кучета, заразени с VL, играят важна роля в предаването на VL на хората19. Контролът на VL зависи от ранното откриване на случая при хора и адекватно лечение. Диагностичните тестове играят основна роля в контрола на VL, както и управлението на пациентите, скринингът на инфекции и епидемиологичните изследвания20. Тъй като има някои доказателства за голямата чувствителност на антигена rK26 при диагностицирането на VL в ранен стадий на инфекция, ние решихме да смесим антигена rK39 с rK26, получен от същия ирански щам на L. infantum за диагностициране на VL при хора и кучета21, 22.

Ние показахме, че rK39 и rK26 носят имунодоминантни епитопи, които могат да бъдат полезни за серологичната диагностика на кучешка и човешка висцерална лайшманиоза.

Реактивността и чувствителността на антителата на тези два рекомбинантни антигена бяха високи, когато бяха използвани паралелно, което предполага, че комбинирането им в тест с една ямка може да подобри ефективността на анализа още повече23.

Резултатите от това проучване показаха, че смес от rK39 и rK26 ELISA може ефективно да открие антитела в инфектирани случаи, като постига висока чувствителност от 95,2% за човешки серуми и 98,9% за кучешки серуми. Проучване в Бразилия съобщава за подобна чувствителност (100%) при използване на антигени rK39 и rK26 чрез RDT (TRALd) при симптоматична CVL диагноза24.

В настоящото проучване смесеният rK39 и rK26 ELISA показва приблизително 100% чувствителност в случаи на паразитологично потвърден VL и висок титър на антитела при кучета и хора, подобно на това, което се наблюдава в rk39 ELISA13. Имаше статистически значима корелация между титъра на антителата и чувствителността25,26,2728. Съществуват различни фактори, влияещи върху нивата на производство на антитела, включително натоварването и видовете заразяващи паразити, формата на заболяването, генетичния фон на гостоприемника и векторните продукти.29. Полът и възрастта са допълнителни фактори, които могат да повлияят на отговора на антителата, но това е извън обхвата на това проучване.

Освен това, мета-анализ на публикуваните данни разкри, че rK39 RDT има по-ниска чувствителност при кучета с клинична инфекция (87%), отколкото при хора със симптоми (94%), заразени с L. donovani или L. infantum27. Нашите данни показват, че смесените rK39 и rK26 повишават чувствителността на теста при симптоматичен CVL (98,9%). Възможно е това да се дължи на увеличаването на rK39 и rK26 имунодоминантни епитопи в този ELISA тест и по-голяма способност на анти-лайшмания антитела в резервоари, за да ги свързват.

Резултатите от rK39 / rK26 ELISA показват висока степен на чувствителност от 87,5% при асимптоматична HVL. Ниска чувствителност на rK39-ELISA (62,5%) е докладвана при самолекуваща се или субклинична човешка инфекция в предишното ни проучване13.Други проучвания върху асимптоматичен HVL описват подобна чувствителност 62,5% при използване на rK39-ELISA30, 31. Значително увеличение с 25% в диагностичната чувствителност във формата на множество епитопи (rK39 / rK26) ELISA се наблюдава при асимптоматични случаи, което показва ефективността на добавяне на антигена rK26 към rK39 в единична ямка.

Въпреки че нивото на титъра на антителата е пряко свързано с тъканното паразитно натоварване и степента на положителност при серологичния тест, резултатите от настоящото проучване показват, че смес от rK39 и rK26 повишава чувствителността на диагнозата при субклинични форми. В настоящото проучване имаше само 3 кучета без клинични признаци и всички те имаха положителен резултат за смесен rK39 и rK26 ELISA.

В к Индексите между rK39 / rK26 ELISA и DAT бяха в пълно съгласие за асимптоматичната група (к= 0,790) и в перфектно съответствие в симптоматичната група при хорак = 0,909) и кучешки резервоарк= 0,995).

Въпреки че е докладвана по-ниска чувствителност за rK39 / rK26 ELISA при асимптоматични човешки случаи, отколкото при симптоматични човешки в това проучване, всички отрицателни проби в асимптоматичната група са свързани с граничния титър на антителата (1: 800) и всички асимптоматични случаи при хора. с титър на антитела 1: 1600 са диагностицирани като VL положителни.

В случай на кучешки резервоари само три случая са асимптоматични, така че отделен анализ не е извършен за асимптоматичната група, но трите кучета с титри на антитела 1:160 са положителни.

При пациенти с клинични симптоми CA-ELISA има чувствителност съответно 93,1% за CVL и 84,6% за HVL, но по-ниски нива на положителност от почти 59,4% са открити в серуми с по-ниски нива на антитела (≤ 1: 1600). Porrozzi et al. също съобщава ниска чувствителност на CA-ELISA (30%) в тази група25. CA-ELISA има по-висока чувствителност при симптоматични кучета в сравнение със същата ситуация при хора.

Изненадващо, въпреки значителното повишаване на чувствителността (84,6%) за CA-ELISA при HVL с клинични признаци в сравнение с друга група, той не успява да постигне добро съгласие във връзката с DATк= 0,340). Обратно, тази стойност е приемлива при кучета с висок титър на антитела (к= 0,763).

Това проучване показва 93% специфичност за смесени rK39 и rK26 Ag при хора, докато специфичността на теста в предишното проучване, което е използвано самостоятелно rK39 Ag в ELISA диагностичните ямки, е 86%13. Това 7% повишаване на специфичността може да бъде ефектът от добавянето на rK26 Ag и увеличаването на специфичните епитопи за откриване на антитела срещу L. infantum. Така че това показва възможността за по-малка кръстосана реактивност със серума на здрави индивиди.

Нашите резултати показват по-ниската специфичност (93%) на ELISA при използване на смесени rK39 и rK26 Ag при хора в сравнение със специфичността, докладвана от Бразилия (98%)24Тази стойност беше определена на 96,7%, когато се използва смесен rK39 и rK26 -ELISA за откриване на антитяло в кучешките зъби. Boario et al. посочва 99% специфичност както при хора, така и при кучешки контролни групи, използвайки химерен (K9, K26 и K39 антигени) ELISA32. Въпреки това, кръстосана реактивност не е наблюдавана за смесени rK39 и rK26 -ELISA в човешки и кучешки серуми с други серуми от инфекциозни заболявания, приложени в настоящото проучване, е докладвана по-малка специфичност на смесени rK39 и rK26 в сравнение с други изследвания. Вероятно се дължи на по-високото разпространение на други инфекциозни заболявания с подобни признаци.

Нито един от серумите от индивиди с други инфекциозни заболявания не дава положителна реакция в смесения rK39 и rK26 ELISA, докато кръстосана реактивност на VL-отрицателни серуми, заразени с кожна лайшманиоза и туберкулоза, се наблюдава за CA в това проучване. Следователно, за разлика от CA-ELISA, смесените rK39 и rK26 -ELISA могат да разграничат истинската лайшманиална инфекция с по-голяма специфичност.

Освен това, в сравнение с комбинираните rK39 и rK26, СА има по-ниска специфичност (53,5% при хора и 83,3% при кучета). Реакциите със серуми на здрави кръводарители и кръстосана реактивност с други инфекции могат да бъдат основните33.

Като цяло, високото валидиране на смесените rK39 и rK26 антигени, сравними с DAT, предполага, че комбинацията от rK39 и rK26 изглежда е добър вариант за диагностициране на симптоматични и асимптоматични инфектирани с VL хора и кучета. CA-ELISA има лошо съгласие със златния стандарт DAT при хора, но отлично съгласие с DAT при кучета.

Бъдещите усилия за оптимизиране на свързването на смесени rK39 и rK26 антигени с нитроцелулозни ленти могат да доведат до бърз и рентабилен тест с измервателна пръчка, който ще промени диагнозата на VL в Иран и други страни, където L. infantumе преобладаващият причинител. Освен това, този тест подобрява чувствителността на анализите за диагностициране на VL при асимптоматичната популация в Иран.