ИРНК бустер ваксинацията защитава възрастните мишки срещу варианта на SARS-CoV-2 Omicron

Животни

Женски, 3-месечни BALB/c мишки бяха закупени от Jackson Laboratory. Женски, 11-месечни BALB/c мишки бяха закупени от Taconic Biosciences и използвани за експерименти с възрастни мишки. Мишките са настанени при специфични условия без патогени в Бостънската детска болница. Всички процедури бяха одобрени от Комитета за институционална грижа и използване на животните (IACUC) и се провеждаха под надзора на Отдела за животински ресурси в Детската болница (протокол номер 19-02-3897 R). В Медицинския факултет на Университета на Мериленд мишките бяха настанени в съоръжение с ниво на биобезопасност 3 за инфекции със SARS-CoV-2 с всички процедури, одобрени съгласно IACUC (Протокол #1120004).

Имунизация

Мишките бяха инжектирани с BNT162b2 SARS-CoV-2 пикова иРНК ваксина (Pfizer-BioNTech). BNT162b2 суспензия (100 µg mRNA/mL) се разрежда 1:5 във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и 50 µL (1 µg) се инжектира интрамускулно в каудалното бедро. BNT162b2 се получава като остатъчни обеми от препълване в използвани флакони от клиниката за ваксини на Бостънската детска болница, като се използва само материал, който иначе би бил изхвърлен, и се използва в рамките на 6 часа от момента на разтваряне. Мишки с фалшиво лечение получават само PBS.

SARS-CoV-2 див тип пик и експресия и пречистване на RBD

SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 шипов гликопротеин с пълна дължина (M1-Q1208, GenBank MN90894) и RBD конструкции (аминокиселинни остатъци R319-K529, GenBank MN975262.1), и двата с HRV3C протеазен сайт за разцепване, TwinStrepTag и 8XHisTag при С-край са получени съответно от Barney S. Graham (NIH Vaccine Research Center) и Aaron G. Schmidt (Ragon Institute). Тези експресионни вектори на бозайници бяха използвани за трансфектиране на суспензионни клетки Expi293F (Thermo Fisher), използвайки полиетиленимин (Polysciences). Клетките бяха оставени да растат при 37 ° C, 8% CO2 за допълнителни 5 дни преди прибиране на реколтата за пречистване. Протеинът се пречиства в PBS буфер (рН 7.4) от филтрирани супернатанти, като се използва или смола StrepTactin (IBA), или смола Cobalt-TALON (Takara). Афинитетните маркери бяха отцепени от елуираните протеинови проби чрез HRV 3C протеаза и протеините с отстранен маркер бяха допълнително пречистени чрез хроматография с изключване на размера, като се използва колона Superose 6 10/300 (Cytiva) за Spike с пълна дължина и колона Superdex 75 10/300 Increase (Cytiva) за RBD домейн в PBS буфер (рН 7,4).

ELISA

Концентрациите на антитела, специфични за шип протеин, се определят количествено в серумни проби чрез ELISA чрез модификация на описан по-рано протокол28. Накратко, плоскодънни 96-ямкови плаки с висока степен на свързване (Corning) бяха покрити с шипов протеин (25 ng на ямка) и инкубирани една нощ при 4 °C. Плаките се промиват с 0.05% Tween 20/PBS и се блокират с 1% говежди серумен албумин (BSA)/PBS за 1 час при стайна температура. Серумните проби бяха серийно разредени четирикратно от 1:100 до 1:1,05 × 108 и след това се инкубира в продължение на 2 часа при стайна температура. Плаките се промиват три пъти и се инкубират в продължение на 1 час при стайна температура с пероксидаза от хрян (HRP)-конюгирана анти-миши IgG, IgG1 и IgG2a (SouthernBiotech). Плаките се промиват пет пъти и се проявяват с тетраметилбензидин (BD OptEIA субстратен разтвор, BD Biosciences) в продължение на 5 минути и след това се спират с 2 NH2ТАКА4. Оптичните плътности (OD) се отчитат при 450 nm с четец на микроплаки SpectraMax iD3 (Molecular Devices). Титрите на крайната точка бяха изчислени като разреждането, което излъчва OD, превишаващ 3x фона. Произволна стойност от 50 беше присвоена на пробите с OD стойности под границата на откриване, за които не беше възможно да се интерполира титърът.

hACE2-RBD инхибиращ анализ

Тестът за инхибиране на hACE2-RBD използва модификация на публикуван по-рано протокол29. Накратко, плоскодънни 96-ямкови плаки с висока степен на свързване (Corning) бяха покрити с рекомбинантен hACE2 (100 ng на ямка) (Sigma-Aldrich) в PBS, инкубирани една нощ при 4 °C, промити три пъти с 0,05% Tween 20 PBS и се блокира с 1% BSA PBS за 1 час при RT. Серумните проби се разреждат 1:160, предварително се инкубират с 3 ng див тип RBD-Fc в 1% BSA PBS за 1 час при стайна температура и след това се прехвърлят в покритата с hACE2 плака. RBD-Fc без предварителна инкубация със серумни проби беше добавен като положителна контрола и 1% BSA PBS без предварителна инкубация на серум беше добавен като отрицателна контрола. След това плаките се промиват три пъти и се инкубират с HRP-конюгиран анти-човешки IgG Fc (SouthernBiotech) в продължение на 1 час при RT. Плаките се промиват пет пъти и се проявяват с тетраметилбензидин (BD OptEIA субстратен разтвор, BD Biosciences) в продължение на 5 минути и след това се спират с 2 NH2ТАКА4. OD се отчита при 450 nm с четец на микроплаки SpectraMax iD3 (Molecular Devices). Процентното инхибиране на свързването на RBD към hACE2 се изчислява като: Инхибиране (%) =[1 − (Sample OD value − Negative Control OD value)/(Positive Control OD value − Negative Control OD value)]× 100.

Тест за неутрализиране на псевдовирус

Псевдовирусите SARS-CoV-2, експресиращи луциферазен репортерен ген, са генерирани по подход, подобен на описания по-рано30,31. Накратко, опаковъчният плазмид psPAX2 (Програма за ресурси и реагенти за СПИН), луциферазен репортерен плазмид pLenti-CMV Puro-Luc (Addgene) и шипов протеин, експресиращ pcDNA3.1-SARS CoV-2 SΔCT на варианти бяха ко-трансфектирани в HEK293T клетки от липофектамин 2000 (ThermoFisher). Псевдовирусите на вариантите на SARS-CoV-2 са генерирани чрез използване на щам WA1/2020 (Wuhan/WIV04/2019, GISAID ID на достъп: EPI_ISL_402124), B.1.617.2 (Delta, GISAID ID на достъп: EPI_ISL_2020950) или B.1.1. 529 (Omicron, GISAID ID: EPI_ISL_7358094.2). Супернатантите, съдържащи псевдотиповите вируси, се събират 48 часа след трансфекцията, които се пречистват чрез центрофугиране и филтруване с 0.45 цт филтър. За да се определи неутрализационната активност на серумните проби, клетките HEK293T-hACE2 се посяват в 96-ямкови плаки за тъканни култури при плътност 2 × 104 клетки/ямка за една нощ. Приготвят се трикратни серийни разреждания на топлинно инактивирани серумни проби и се смесват с 50 ul псевдовирус. Сместа се инкубира при 37 ° С в продължение на 1 час преди добавяне към HEK293T-hACE2 клетки. След 48 часа клетките се лизират в Steady-Glo Luciferase Assay (Promega) съгласно инструкциите на производителя. Неутрализационните титри на SARS-CoV-2 се определят като разреждането на пробата, при което се наблюдава 50% намаление на относителната светлинна единица (RLU) спрямо средната стойност на контролните ямки за вируса.

Рестимулация на спленоцити, оцветяване с вътреклетъчни цитокини и поточна цитометрия

Мишите далаци се дисоциират механично и се филтруват през 70 цт клетъчна цедка. След центрофугиране, клетките се третират с 1 mL амониев хлорид-калиев лизисен буфер за 2 минути при RT. Клетките се промиват и се поставят в 96-ямкова U-дънна плака (2 × 106/ямка) и се инкубира за една нощ в RPMI 1640, допълнен с 10% топлинно инактивиран FBS, пеницилин (100 U/ml), стрептомицин (100 mg/ml), 2-меркаптоетанол (55 mM), неесенциални аминокиселини (60 mM ), HEPES (11 тМ) и L-глутамин (800 тМ) (всички Gibco). На следващия ден бяха добавени SARS-CoV-2 див тип (PM-WCPV-S-1) или Omicron (PM-SARS2-SMUT08-1) пикови пептидни пулове (JPT) при 0,6 nmol/ml в присъствието на анти-миши CD28 /49d (1 μg/mL, BD) и брефелдин А (5 μg/mL, BioLegend). След 6 часа стимулация, клетките се промиват два пъти и се третират с Mouse Fc Block (BD) съгласно инструкциите на производителя. Клетките се промиват и оцветяват с Aqua Live/Dead оцветяване (Life Technologies, 1:500) за 15 минути при RT. След две допълнителни промивания, клетките се инкубират със следните Abs за 30 минути при 4 °C: анти-миши CD44 [IM7, PerCP-Cy5.5, BioLegend #103032, 1:160]анти-миши CD3 [17A2, Brilliant Violet 785, BioLegend #100232, 1:40]анти-миши CD4 [RM4-5, APC/Fire 750, BioLegend 100568, 1:160] и анти-миши CD8 [53-6.7, Brilliant UltraViolet 395, BD #563786, 1:80]. След това клетките се фиксират и пермеабилизират с помощта на комплекта BD Cytofix/Cytoperm в съответствие с инструкциите на производителя и се подлагат на вътреклетъчно оцветяване (30 минути при 4 °C), като се използват следните Abs: анти-миши IFNy [XMG1.2, Alexa Fluor 488, BioLegend #505813, 1:160]анти-миши TNF [MP6-XT22, PE Cy7, BioLegend # 506324, 1:160]анти-миши IL-2 [JES6-5H4, PE, BioLegend # 503808, 1:40]. Накрая, клетките се фиксират в 1% параформалдехид (Electron Microscopy Sciences) за 20 минути при 4 ° С и се съхраняват в PBS при 4 ° С до придобиване. Пробите бяха анализирани на LSR II (BD) поточен цитометър и FlowJo v10.8.1 (FlowJo LLC).

Проучване за предизвикване на SARS-CoV-2 Omicron

Мишките се анестезират интраперитонеално с 50 μL кетамин (1,3 mg/мишка) и ксилазин (0,38 mg/мишка), разредени в PBS. След това мишките бяха интраназално инокулирани с 1 × 105 PFU на SARS-CoV-2 Omicron (BA.1), с любезното съдействие на Dr. Mehul Suthar, в 50 μL PBS, разделен между носовете. Заразените мишки се претеглят ежедневно. На ден 2 след заразяването, мишките бяха евтаназирани и белите дробове бяха събрани за хистология, анализ на отговорите на гостоприемника чрез qPCR и определяне на вирусен титър чрез анализ на плака.

Тест за плака SARS-CoV-2

В деня преди инфекцията, 2.5e5 VeroTMPRSS2 клетки бяха посяти на ямка в 12-ямкова плака в 1 mL VeroTMPRSS2 среда [DMEM (Quality Biological), 10% FBS (Gibco), 1% Penicillin-Streptomycin (Gemini Bio Products), and 1% L-Glutamine (Gibco)]. Тъканните проби се размразяват и хомогенизират с 1 mm перли в Bead ruptor (Omni International Inc.) и след това се въртят надолу при 21 000 g за 2 минути. Беше изготвена 6-точкова крива на разреждане чрез серийно разреждане на 25 μL от пробата 1:10 в 225 μL DMEM. След това към клетките се добавят 200 μL от всяко разреждане и плочите се разклащат на всеки 15 минути в продължение на 1 час при 37 °C. След 1 час към всяка ямка се добавят 2 mL полутвърдо покритие от агароза [DMEM, 4% FBS, and 0.06% UltraPure agarose (Invitrogen)]. След 72 часа при 37 °C и 5% CO2плочките се фиксират в 2% PFA за 20 минути, оцветяват се с 0,5 mL 0,05% Crystal Violet и 20% EtOH и се промиват два пъти с H2O преди преброяването на плаките. След това се изчислява титърът. За тъканни хомогенати този титър се умножава по 40 въз основа на средното тегло на тъканната проба от 25 mg.

Анализ на генната експресия чрез qPCR

РНК се изолира от проби с реагент TRI, като се използва екстракция с фенол-хлороформ или колонни системи за екстракция (Direct-zol RNA Miniprep, Zymo Research) съгласно протокола на производителя. Концентрацията и чистотата на РНК (съотношения 260/280 и 260/230) бяха измерени от NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Проби със съотношение A260/A280 <1,7 бяха изключени за допълнителен анализ. сДНК се получава от пречистена РНК с RT2 First Strand Kit, според инструкциите на производителя (Qiagen). cDNA се определя количествено чрез qPCR на 7300 PCR система в реално време (Applied Biosystems), използвайки предварително проектирани SYBR Green Primers (QIAGEN), специфични за Ifit2 (PPM05993A), Rsad2 (PPM26539A) и Rpl13a (PPM03694A).

Статистика и възпроизводимост

Експериментите с мишки имаха за цел да включат общо 20 мишки на група и бяха от единични експерименти. Размерът на извадката и критериите за възраст бяха избрани емпирично въз основа на резултатите от предишни проучвания. Мишките бяха разпределени на случаен принцип в различни групи за лечение. Не са изключени отклонения в данните. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на Prism v9.0.2 (софтуер GraphPad). Двуопашат П стойности <0,05 се считат за значими. Нормално разпределените данни бяха анализирани чрез еднопосочни анализи на дисперсията (ANOVA), коригирани за множество сравнения. Ненормално разпределените данни бяха логаритмично трансформирани и анализирани чрез ANOVA или анализирани чрез тест на Kruskal-Wallis, коригиран за множество сравнения.

Резюме на отчета

Допълнителна информация относно дизайна на изследването е достъпна в Резюме на докладите за научни изследвания в природата, свързано с тази статия.