Неутрализация на Omicron BA.1, BA.2 и BA.3 SARS-CoV-2 с 3 дози ваксина BNT162b2

Етично изявление

Цялата работа с вируси беше извършена в лаборатория на ниво 3 на биобезопасност (BSL-3) с излишни вентилатори в шкафовете за биобезопасност в Медицинския клон на Университета на Тексас в Галвестън. Целият персонал носеше задвижвани респиратори за пречистване на въздуха (Breathe Easy, 3M) с костюми Tyvek, престилки, обувки и двойни ръкавици.

клетки

Vero E6 (ATCC® CRL-1586) е закупен от American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) и поддържан в високоглюкозна модифицирана среда на Dulbecco на Eagle (DMEM), допълнена с 10% фетален говежди серум (FBS; HyClone). Laboratories, South Logan, UT) и 1% пеницилин/стрептомицин при 37 ° C с 5% CO2. Всички култури и антибиотици са закупени от ThermoFisher Scientific (Waltham, MA). Клетъчната линия е отрицателна за микоплазма.

Човешки серум

Серумните проби бяха събрани от ваксинирани с BNT162b2, участващи във фаза 1 част от текущото клинично изпитване фаза 1/2/3 (идентификатор на ClinicalTrials.gov: NCT04368728). Протоколът и информираното съгласие бяха одобрени от институционални съвети за преглед за всеки от разследващите центрове, участващи в проучването. Проучването е проведено в съответствие с всички насоки на Международния съвет за хармонизиране на добрата клинична практика и етичните принципи на Декларацията от Хелзинки. Първичните резултати за фаза 1 бяха докладвани по-рано15.16. Ваксиниран с BNT162b2 серум (n = 22) беше събран в деня на третата доза BNT162b2, която беше приложена на 7,9–8,8 месеца след втората доза; и серуми, събрани 1 месец след третата доза, бяха използвани в настоящото изследване за тестване за неутрализация. Таблица S1 обобщава информацията за пациента (напр. възраст и пол) и времевите точки за вземане на проби. Информацията за серумните панели беше докладвана по-рано17.18.

Конструиране и характеризиране на рекомбинантна подлиния Omicron mNG SARS-CoV-2s

Рекомбинантните Omicron BA.1-, BA.2- и BA.3-spike mNG SARS-CoV-2 са конструирани чрез проектиране на пълния шипове ген от подлинии Omicron в инфекциозен cDNA клон на mNG USA-WA1 / 202019 (фиг. S1a). Всички шипове мутации, делеции и инсерции бяха въведени в инфекциозния сДНК клон на mNG USA-WA1 / 2020 с помощта на PCR-базирана мутагенеза, както е описано по-горе20. Шиповите последователности BA.1, BA.2 и BA.3 са базирани на GISAID EPI_ISL_6640916, EPI_ISL_6795834.2 и EPI_ISL_7605591, съответно. КДНК с пълна дължина на вирусния геном, съдържащ пълния шип на Omicron, беше сглобен чрез in vitro лигиране. Получената сДНК с пълна дължина се използва като шаблон за in vitro транскрипция на вирусна РНК с дължина на генома. In vitro транскрибираната вирусна РНК се електропорира във Vero E6 клетки. На 3-ия ден след електропорацията, оригиналният вирусен материал (Р0) се събира от електропорираните клетки. Вирусът P0 беше амплифициран за друг кръг върху клетки Vero E6, за да се получи P1 запас за тестване за неутрализация. Инфекциозният титър на вируса P1 се определя количествено чрез флуоресцентен фокусен анализ върху Vero E6 клетки (фиг. S1b). Ние секвенирахме пълния spike ген на вируса P1, за да гарантираме липса на нежелани мутации. За теста за неутрализиране са използвани само вирусите P1. Протоколите за мутагенезата на mNG SARS-CoV-2 и производството на вируси бяха докладвани по-рано21. За да определим специфичната инфекциозност, ние определихме количествено P1 вирусните запаси за техните флуоресцентни фокусни единици (FFU) и съдържанието на геномна РНК чрез флуоресцентен фокусен анализ върху Vero E6 клетки и RT-qPCR, съответно. Методите за флуоресцентен фокусен анализ и RT-qPCR бяха докладвани по-рано4.22. Специфичната инфекциозност на всеки вирус се измерва чрез съотношенията на геномната РНК към FFU (геном / FFU).

Тест за неутрализиране на флуоресцентно намаляване на фокуса

Неутрализационните титри на човешки серуми бяха измерени чрез FFRNT с помощта на USA-WA1 / 2020, BA.1-, BA.2- и BA.3-spike mNG SARS-CoV-2s. Подробностите за протокола FFRNT бяха съобщени по-рано4. Накратко, 2,5 × 104 Vero E6 клетки на ямка се посяват в 96-ямкови плаки (Greiner Bio-one (). Клетките се инкубират за една нощ. На следващия ден всеки серум се разрежда 2 пъти серийно в културалната среда с първото разреждане 1:20 (краен диапазон на разреждане от 1:20 до 1:20,480). Разреденият серум се инкубира със 100-150 FFU от mNG SARS-CoV-2 при 37 ° C в продължение на 1 час, след което смесите от серум-вирус се зареждат върху предварително засадения клетъчен монослой Vero E6 в 96-ямкови плаки. След 1 h инфекция, инокулумът се отстранява и към всяка ямка се добавят 100 μl наслагваща се среда (допълнена с 0,8% метилцелулоза). След инкубиране на плаките при 37 ° C в продължение на 16 часа, сурови изображения на mNG фокуси бяха получени с помощта на CytationTM 7 (BioTek), въоръжен с обектив 2,5 × FL Zeiss с широко зрително поле и обработен с помощта на софтуерните настройки на Gene 5 (GFP [469,525] праг 4000, размер за избор на обект 50–1000 µm). Фокусите във всяка ямка бяха преброени и нормализирани към нетретираните със серум контроли за изчисляване на относителната инфекциозност. FFRNT50 стойността се определя като минималното разреждане на серума, което потиска> 50% от флуоресцентните огнища. Неутрализационният титър на всеки серум се определя в два екземпляра и се взема средната геометрична стойност. Всички опити за репликация бяха успешни. Таблица S1 обобщава FFRNT50 резултати. Данните първоначално бяха начертани в софтуера GraphPad Prism 9 и събрани в Adobe Illustrator.

Статистика

За анализ на статистическата значимост на фиг. 1

Резюме на отчета

Допълнителна информация относно дизайна на изследванията е налична в Резюмето за докладване на изследванията в природата, свързано с тази статия.