Хистопатологична оценка на елуиращ стент с ретиноева киселина в модел на илиачна артерия на заек

Проучването е проведено в съответствие с указанията на ARRIVE24 и законодателството на Европейския съюз25 следвайки принципа на 3Rs (намаляване, усъвършенстване, замяна), за да се гарантира: намаляване на броя на използваните животни, подобряване на експерименталните техники и условията им на живот, така че те да бъдат сведени до минимум болка или страдание. Експериментите са проведени във Фондацията за биомедицински изследвания на Атинската академия, Гърция / Атина. Протоколът беше одобрен от Комитета за оценка на протокола на Фондациите за биомедицински изследвания на Академията в Атина, Гърция и Дирекцията по селскостопанска и ветеринарна политика на Префектура Атика, Гърция, държавен орган. Всички методи бяха извършени в съответствие със съответните национални и международни насоки и разпоредби.

Поставяне на стент

Ендоваскуларни стентове бяха имплантирани в илиачните артерии на 30 мъжки новозеландски зайци (2,5 до 3,5 kg). Моделът на илиачна артерия на заек беше избран като първи тест за предклиничната оценка на стентовете, излъчващи RA, тъй като размерът и реакцията на нараняване на илиачните артерии на заек са относително сравними с човешките коронарни артерии22,26. Животните бяха индивидуално настанени в клетки от неръждаема стомана. Два стента от същата група бяха имплантирани във всеки заек, по един стент във всяка илиачна артерия. Бяха използвани общо шестдесет стента, които бяха разделени на десет групи, шест стента на група, три животни на група. Периодът на наблюдение след имплантирането е 4 седмици.

Процедури за имплантиране на стент

Зайците бяха анестезирани чрез интрамускулно инжектиране на кетамин (35 mg/kg) и ксилазин (7 mg/kg) и бяха наблюдавани чрез периферна пулсова оксиметрия по време на процедурата. Използвахме публикуван метод за перкутанен трансаурикуларен ендоваскуларен достъп27. Накратко, животните бяха поставени в легнало положение и обездвижени. И двете аурикуларни дорси бяха обръснати и стерилизирани с повидон-йод. Начинаещ стажант и опитен интервенционален кардиолог извършиха трансаурикуларния съдов достъп, елективни съдови катетеризации и имплантиране на стент в илиачните артерии.

За първоначалните имплантации и за установяване на точно поставяне на стент, както и за събиране на данни, изисквани от паралелно проучване, целящо да се разработи in silico симулация на процеса на разширяване28 оптична кохерентна томография (OCT) беше извършена след процедурата в малък брой стентове (Ν = 4). Подготовката и материалите, използвани за процеса, бяха леко модифицирани за онези случаи, в които беше извършен OCT.

Централната аурикуларна артерия беше пробита с интравенозен катетър 22-калибър приблизително в дисталната половина на нейния подкожен ход. След това се отстранява централната игла на катетъра. 0,018-инчов (V18, Boston science, MA) хидрофилен водещ проводник беше внимателно придвижен във външната каротидна артерия и аортната дъга / низходящата аорта и след това в гръдната аорта. Катетърът се отстранява и се извършва 3-cm дълъг разрез на дермата в точката на първоначалната пункция по хода на водещия проводник до основата на дорзата. В случаите, когато е планирано да се извърши OCT, 5-F съвместима 0,035-инчова, тънка интродюсерна обвивка (Терумо, Токио, Япония) се придвижва във външната каротидна артерия след серийни дилатации стъпка по стъпка със собствения дилататор на обвивката. Бяха извършени многократни разширения чрез кабела, за да се отстрани стегнатият и тесен периферен сегмент на артерията преди поставянето на обвивката. След това се прилага интраартериално хепарин (100 IU/kg). При получаване на достъп 5F водещ катетър (Envoy MPC, Codman, САЩ) беше придвижен до дисталната аорта, за да се получи директна връзка с целевите съдове и беше извършена ангиография за визуална оценка на диаметъра на съда и като пътна карта за достъп до феморални съдове. След ангиографията телта беше заменена с 0,014-инчова жица (Lotus II, Rontis, Швейцария) и тя беше придвижена към феморалната артерия. Накрая, стентът беше препратен и поставен, няколко милиметра след началото на илиачната артерия (10 Atm, 20 s). След имплантирането на стента, OCT беше извършен без контрастна материя, но само чрез промиване с физиологичен разтвор.

В случаите, когато OCT не е планиран, процесът е точно същият като по-горе, до точката на въвеждане на употреба на интродюсерната обвивка. 4-F, 0,018-инчова съвместима обвивка Radifocus Introducer II (Terumo, Токио, Япония) беше използвана за получаване на точката за достъп и следните дейности бяха същите като описаните по-горе. Друга диференциация беше на водещия катетър, където горепосоченият катетър беше заменен с 4-F ангиографски катетър (Impress VER-H, Merit Medical, САЩ). Беше извършена последна ангиография за оценка на апозицията на стента, съдовата проходимост и наличието на възможни усложнения (напр.: образуване на тромб, наличие на интимално ламбо, неоптимално разгърнат стент и др.). Животните не са получавали никакви антитромбоцитни лекарства.

Тип стентове

За приготвянето на стентове, отделящи лекарството, кобалтово-хромови голи метални стентове (Leader Plus, Rontis, Zug, Швейцария) с размери 12 mm дължина × 2,50 mm диаметър бяха покрити с покрития, състоящи се от смес от полимер и лекарство (Таблица 3) . Използвани са два различни вида полимери, полимер “А”, поли (млечна-ко-гликолова киселина) (PLGA) и полимер “В”, поли млечна киселина (PLA). Използвани са три различни дози от лекарството RA с полимери “A” и “B”, което води до три групи стентове за всеки полимер: AL, AM, AH с полимер A и съответно “ниска”, “средна” и “висока” доза и BL, BM, BH с полимер B и съответно “ниска”, “средна” и “висока” доза. Тъй като ретиноевата киселина е чувствителна към светлина и кислород, бяха взети мерки за защита на лекарството от разграждане по време на процеса на покриване и съхранение. С лекарството се работи при слаба жълта светлина по време на приготвянето на покривните смеси. След нанасяне на покритие и кримпване върху катетри, стентовите системи бяха опаковани в непрозрачни опаковки от алуминиево фолио с абсорбери за влага и кислород. За да се гарантира количеството на лекарството върху стентовете, бяха извършени тестове за контрол на качеството след производството. Две групи стентове, а именно EF и EG със същата доза еверолимус, бяха приготвени с използването на полимери А и В съответно. Всички покрити стентове бяха нагънати върху системите за доставяне на стент Leader Plus на Rontis с размери 2,5 × 12 (REF: LP20/12).

Таблица 3 Видове стентове, състав на покритията и лекарствените дози на изследваните артикули.

Стентове от гол метал (без покритие) на Rontis Cobalt-Chrome и предлагани в търговската мрежа елуиращи стентове с Everolimus (Xience Pro Everolimus Eluting Coronary Stent System, Abbot Vascular, Santa Clara CA, USA) също бяха използвани със същия размер (съответно група C и D). Видовете стентове, съставите на покритията и лекарствените дози на тестваните елементи са включени в таблица 3.

Некропсия и хистоморфометрия

Животните бяха евтаназирани с инжекция с натриев пентобарбитон. Аутопсията е извършена от опитен ветеринарен лекар. Третираните артериални сегменти бяха събрани и запазени в 10% неутрален буфериран формалин и прехвърлени за хистологична обработка, анализ на изображението и хистопатологична оценка. Хистологията и морфометрията бяха извършени в независима сертифицирана лаборатория за добра лабораторна практика (Anapath Services, GmbH, Швейцария) от сертифициран от борда ветеринарен патолог. Пробите от местата на имплантиране бяха обработени чрез вграждане на смола от метилметакрилат (MMA), изрязани с диамантен лентов трион в напречна посока на пробата (EXAKT System), шлифовани и полирани до крайна дебелина от приблизително 40–60 µm (EXAKT System). Един участък от всяка проба беше оцветен с адаптирано оцветяване Paragon, следвайки стандартните оперативни процедури. Беше извършена оценка на слайдовете за проверка на качеството и след това слайдовете бяха прехвърлени на патолога на изследването за оценка на патологията.

Параметри за оценка

Параметрите, оценени чрез хистопатологично изследване, адаптирано към точковата система, описана в ISO 10993-6:2016, бяха: артериална реакция [endothelial loss (%), surface (fibrin/platelet thrombus), intima proliferation, smooth muscle in intima proliferation, proteoglycan/collagen]възпаление на артерия (интима/медия, адвентиция), загуба на медиални гладкомускулни клетки (SMC). [Medial SMC loss (transmural), Medial SMC loss (circumference)], тъкан за заместване на артериални клетки (протеогликани, колаген, адвентиция), реакция на гостоприемника, свързана с импланта (полиморфонуклеарни клетки, лимфоцити, плазмени клетки, макрофаги, гигантски клетки, некроза, фиброза, кръвоизлив в периструта/натрупване на фибрин, неоваскуларизация, мастен инфилтрат), еластичен ламина (EL) руптура (външна EL руптура, вътрешна EL руптура), медиална хипертрофия (фокална, дифузна). Приложена е адаптирана система за оценяване, описана в ISO 10993-6:2016. Всеки параметър се оценява от 0 до 4 според хистологичните находки. Определена от ISO 10993-6:2016, резултатна разлика между 0,0 до 2,9 се счита за липса или минимална реакция на гостоприемника, 3,0 до 8,9 лека реакция на гостоприемника, 9,0 до 15,0 умерена реакция на гостоприемника и ≥ 15,1 тежка реакция на гостоприемника в сравнение с референтен материал.

Скенер за слайдове Olympus Slideview VS200 с помощта на камера Olympus U-TV1XC и 20× обектив беше използван за сканиране на артериалните проби. Количествената оценка беше извършена с помощта на софтуер за изображения и анализ на изображения Olympus cellSens v1.18.

Беше извършена количествена оценка чрез анализ на изображението на всяка артерия, включително следните параметри: Площ във външната еластична ламина (EEL; µm2), площ във вътрешната еластична ламина (IEL; µm2), лумен (µm2), интима (µm2) (изчисление: IEL-лумен), среда (µm2) (изчисление: EEL − IEL), стеноза (%) [calculation:100 − (100 × Lumen/IEL)], дебелина на интимата (µm) (средна стойност от 10 приблизителни еквидистантни измервания на дебелината). Тези средноаритметични стойности бяха използвани за допълнителна описателна статистика. Илюстративни изображения с измерванията, по едно за всяка група, са показани на фиг. 3. Тъй като артериите не бяха промити по време на вземането на проби, за да се избегне пропускането на евентуално наличие на локална тромбоза, червените кръвни клетки (кръгли безядрени клетки) присъстваха в лумените на няколко артерии.

Фигура 3

Представителни изображения, показващи измервания, по едно изображение на група за лечение. Парагон, обектив ×20. Изображенията показват параметри на измерване, външна еластична ламина (EEL), вътрешна еластична ламина (IEL), лумен, интима и медия. Използвани са десет приблизителни еквидистантни измервания за измерване на дебелината на интимата. А Полимер А; PLG поли (млечно-ко-гликолова киселина); б полимер В; PLA полимлечна киселина; Л ниска (доза); М средна (доза), з висока (доза); ° С Rontis гол метален стент; д Xience Pro everolimus елуираща коронарна стент система, Abbot vascular; EF и EG Стентове Rontis everolimus с използване на полимери А и В съответно. RA ретиноева киселина.

Статистически анализ

Статистическите тестове бяха извършени с помощта на софтуера Prism 8 (GraphPad, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Използвани са описателни статистики за медиална област, интимална област, стеноза и дебелина на интимата. Извършен е тестът на Shapiro-Wilk за нормалност. Когато данните следват нормално разпределение, сравненията се извършват с несдвоения t-тест. Когато данните не следват нормалното разпределение, се използва тестът на Ман-Уитни. Стойност на р по-малка от 0,05 се счита за значима.